采用病毒滴度為104.5 TCID50/ml的EV71（NX10-147）經(jīng)腹腔注射感染9日齡BALB/c乳鼠，建立重癥小鼠模型，6 dpi重癥模型小鼠發(fā)生后肢癱瘓最終導(dǎo)致死亡；繪制生存率（圖1A），體重增長(zhǎng)曲線（圖1B），臨床評(píng)分（圖1C）。重癥小鼠模型在5 dpi時(shí)，2/7(28.57%)小鼠發(fā)生后肢癱瘓（圖2），在7 dpi時(shí)，4/7(57.14%)小鼠表現(xiàn)癱瘓，其體重也下降，11~12 dpi重癥小鼠出現(xiàn)死亡，生存率為71.43%(5/7)，其中存活的小鼠中60%(3/5)出現(xiàn)癱瘓后遺癥。

圖1. EV71毒株（NX10-147）104.5 TCID50經(jīng)腹腔注射感染乳鼠建立重癥小鼠模型的生存率、體重、臨床評(píng)分

A.生存率; B. 體重; C. 臨床評(píng)分

圖2. 重癥EV71小鼠模型主要癥狀

1.重癥小鼠模型各組織病毒載量檢測(cè)

為了進(jìn)一步探討重癥EV71小鼠模型體內(nèi)病毒載量情況，采用RT-PCR對(duì)3 dpi和5 dpi重癥小鼠腦、脊髓、骨骼肌、空腸和肺組織進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)（圖3），發(fā)現(xiàn)以上各組織在3 dpi和5 dpi 均檢測(cè)到EV71病毒，其中，檢測(cè)到重癥模型3 dpi骨骼肌中的高病毒載量（107.0 copies/mg），其中，3 dpi 在重癥模型腦組織中均檢測(cè)到低病毒載量(102.0 copies/mg)，5 dpi腦組織中病毒載量增加到104.0 copies/mg，說(shuō)明5 dpi EV71病毒造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染加重。3 dpi在重癥模型脊髓、空腸和肺組織中的病毒載量104.0 copies/mg，5 dpi 病毒載量無(wú)明顯變化，重癥小鼠模型中均檢測(cè)到骨骼肌和脊髓中較高的病毒載量，說(shuō)明這些組織是病毒復(fù)制并傳播到腦組織的重要部位。

圖3. EV71毒株（NX10-147）104.5 TCID50經(jīng)腹腔注射感染乳鼠建立重癥小鼠模型的組織內(nèi)病毒載量

2.重癥小鼠模型組織病理學(xué)變化

運(yùn)用組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)技術(shù)，對(duì)重癥小鼠模型的各組織器官進(jìn)行病理學(xué)觀察?？瞻讓?duì)照組小鼠未見明顯病理變化，并且EV71抗原呈陰性反應(yīng)。

對(duì)重癥小鼠模型（NX10-147）進(jìn)行組織病理學(xué)觀察（圖4），發(fā)現(xiàn)3 dpi和5 dpi 小鼠后肢骨骼肌發(fā)生嚴(yán)重的壞死性肌炎，肌纖維斷裂，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，主要有淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞；3 dpi 小鼠脊髓和腦干發(fā)生細(xì)胞源性水腫，神經(jīng)元發(fā)生變性，偶見壞死，5 dpi小鼠脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性壞死，出現(xiàn)紅色神經(jīng)元，并可見衛(wèi)星現(xiàn)象和嗜神經(jīng)現(xiàn)象，腦干組織中的神經(jīng)元發(fā)生不同程度的變性壞死，并且可見腦干和脊髓神經(jīng)元中的尼氏小體消失；5 dpi肺臟發(fā)生大面積間質(zhì)性肺炎，間質(zhì)增寬，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔毛細(xì)血管淤血，3 dpi和5 dpi肺臟發(fā)生局灶性肺氣腫；3 dpi和5 dpi空腸黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生大面積空泡變性。免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在上述嚴(yán)重病變的組織中可觀察到EV71特異性抗原分布（圖5），在3dpi和5 dpi時(shí)，脊髓、腦干、空腸和骨骼肌檢測(cè)到較強(qiáng)的陽(yáng)性EV71抗原信號(hào)，提示在這些組織中病毒復(fù)制活躍，然而在5 dpi時(shí)，肺臟檢測(cè)到中等強(qiáng)度陽(yáng)性EV71抗原信號(hào)。

圖 4. 重癥小鼠模型各組織的組織病理學(xué)檢測(cè)

圖注：9日齡BALB/c乳鼠腹腔注射104.5 TCID50 EV71毒株（NX10-147），3dpi和5dpi解剖取材，圖片顯示各組別的典型組織照片（×200），箭頭指示5dpi各組織典型病理變化，對(duì)照組小鼠組織未見明顯病理變化。

圖5. 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)重癥小鼠模型各組織中的EV71VP2蛋白

圖注：重癥小鼠的骨骼肌、脊髓、腦干、肺以及空腸組織中可檢測(cè)到陽(yáng)性EV71抗原（棕黃色顆粒）（×200），在空白對(duì)照組的上述組織中未見陽(yáng)性EV71抗原。

3.重癥小鼠模型血清細(xì)胞因子檢測(cè)

對(duì)重癥小鼠模型進(jìn)行血清細(xì)胞因子檢測(cè)從血清細(xì)胞因子方面揭示重癥發(fā)生機(jī)制。本研究采用CBA方法檢測(cè)了重癥小鼠的3、6、12 hpi 以及1、2、3、5、7、9 dpi的血清細(xì)胞因子IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、TNF-α、IFN-γ，以及MCP-1、CCL5/RANTES的動(dòng)態(tài)變化（圖6）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些血清因子中，IL-5、IL-13、IL-6、MCP-1、CCL5、TNF-α在重癥小鼠中發(fā)生某時(shí)間點(diǎn)的爆發(fā)性濃度增高，與空白對(duì)照組小鼠血清因子相比，發(fā)現(xiàn)重癥小鼠血清爆發(fā)性增高的細(xì)胞因子分別是3 hpi重癥IL-5上調(diào)4倍；48 hpi重癥IL-13上調(diào)1.2倍；3 dpi重癥IL-6、MCP-1都上調(diào)100倍以上；3 dpi和7 dpi重癥CCL5/RANTES分別上調(diào)9倍和10倍；重癥小鼠模型中的IFN-γ在5 dpi時(shí)達(dá)到峰值，重癥為10倍；7 dpi重癥TNF-α和MCP-1分別上調(diào)4倍和87倍。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明，IL-5和IL-13可能是EV71小鼠實(shí)驗(yàn)感染早期炎癥反應(yīng)的主要因素，并且細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、CCL5/RANTES在重癥EV71實(shí)驗(yàn)感染的免疫病理?yè)p傷中發(fā)揮重要作用。

圖6. 動(dòng)態(tài)檢測(cè)重癥小鼠血清中的炎性細(xì)胞因子變化

圖注：流式細(xì)胞小球微陣列術(shù)（CBA）檢測(cè)血清中細(xì)胞因子濃度變化：A.IL-5; B. IL-13; C. IL-6; D. MCP-1; E. CCL5/RANTES; F. TNF-α; G. IFN-γ. 感染后出現(xiàn)因子濃度變化倍數(shù)比較顯示在圖H中。

4. EV71重癥小鼠模型的氣道阻力和血?dú)夥治?/p>

對(duì)小鼠的氣道阻力進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)小鼠的吸氣時(shí)間延長(zhǎng)，呼吸頻率降低，分鐘通氣量顯著降低（圖7），符合限制性通氣不足的特征，可能是小鼠死亡的主要原因之一。

采用血?dú)夥治龇椒▽?duì)EV71重癥小鼠模型組和對(duì)照組小鼠的呼吸效果進(jìn)行分析，與對(duì)照組相比，4 dpi感染組小鼠的氧分壓（PO2）和氧飽和度（sO2）均明顯下降，PO2 由62.2 mmHg下降到 46.75 mmHg，差異極顯著（p < 0.01）（圖8A）；sO2由90.6 %下降到76.5 %，差異極顯著（p< 0.01）（圖8B），PO2和sO2的變化提示EV71重癥模型組小鼠處于缺氧狀態(tài)。并且發(fā)現(xiàn)二氧化碳分壓（PCO2）和二氧化碳總量（TCO2）有所上升，PCO2由27.22 mmHg增加到46.25 mmHg，差異顯著（p< 0.05）（圖8D）；TCO2由24.00 mmol/L 增加到25.75 mmol/L（圖8E），PCO2的變化提示EV71重癥模型組小鼠肺通氣效果可能存在障礙。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了血液酸堿度pH值和細(xì)胞外液堿剩余（BEecf）均明顯下降，pH值由7.42下降到7.33，差異顯著（p< 0.05）（圖8C）；BEecf由1 mmol/L降低到–2.25 mmol/L，差異顯著（p < 0.05）（圖8F），提示重癥模型組小鼠可能處于呼吸性酸中毒的狀態(tài)。以上血?dú)饨Y(jié)果結(jié)合肺臟組織病理變化，說(shuō)明EV71重癥模型組小鼠肺臟通氣功能低下，處于缺氧和呼吸性酸中毒的病理狀態(tài)。

圖7.重癥EV71小鼠模型的氣道阻力分析

圖8. EV71感染小鼠導(dǎo)致血液各項(xiàng)指標(biāo)變化。

圖注：4 dpi模型組和對(duì)照組小鼠血液中的(A) 氧分壓PO2,(B) 氧飽和度sO2,(C)pH值,(D) 二氧化碳分壓PCO2,(E) 二氧化碳總量TCO2,(F) 細(xì)胞外液堿剩余BEecf指標(biāo)檢測(cè)。

5. EV71小鼠模型超微病理學(xué)變化

對(duì)照組小鼠肌肉組織可見橫紋明顯，每條肌原纖維都可見清晰明帶和暗帶交替排列，肌質(zhì)內(nèi)含有豐富的線粒體、肌原纖維、高爾基復(fù)合體、溶酶體、糖原顆粒等肌漿內(nèi)含物，糖原顆粒散在分布于肌原纖維間和肌漿中（圖9A），肌細(xì)胞內(nèi)可見清晰的線粒體，或在肌纖維間排列，其內(nèi)外膜和嵴突結(jié)構(gòu)清晰可見（圖9B）。感染組小鼠肌肉組織超微病變明顯，表現(xiàn)為肌組織橫紋消失，明暗帶模糊甚至消失，肌組織發(fā)生退行性變，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)水腫，部分肌原纖維發(fā)生溶解，肌質(zhì)中的胞漿內(nèi)容物減少，糖原顆粒甚至消失（圖9C）；線粒體腫脹、空化，基質(zhì)電子密度降低，內(nèi)室腫脹，嵴和膜結(jié)構(gòu)模糊，嵴突變短減少，崩解消失，形成灶性空化（圖9D）；骨骼肌細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)邊集，異染色質(zhì)明顯增多，發(fā)生變性、壞死。并且在肌纖維間可見巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

對(duì)照組腦組織中神經(jīng)元胞漿中的細(xì)胞器豐富，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)，平行或不規(guī)則排列，其間游離存在核糖體（圖10A）；線粒體豐富，散布于整個(gè)胞體中，線粒體內(nèi)外膜和嵴突結(jié)構(gòu)清晰（圖10B）；腦組織中有髓神經(jīng)纖維髓鞘電子密度均勻（圖10C）。感染組腦組織超微病變輕微，神經(jīng)元細(xì)胞器豐富，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)，線粒體豐富（圖10D）；神經(jīng)元胞漿中可見少量空泡，部分線粒體內(nèi)室腫脹(圖10E)；有髓神經(jīng)纖維髓鞘發(fā)生層面分離，導(dǎo)致小泡性分離，呈現(xiàn)泡狀改變（圖10F）。

對(duì)照組脊髓前角神經(jīng)元常染色質(zhì)明顯，異染色質(zhì)少，細(xì)胞器豐富（圖11A）；脊髓前角神經(jīng)元胞質(zhì)中線粒體豐富，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)（圖11B）。感染組脊髓前角神經(jīng)元中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，出現(xiàn)尼氏小體溶解，核周見微空泡形成；胞核皺縮，異染色質(zhì)增多，細(xì)胞器減少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體呈現(xiàn)不同程度的擴(kuò)張，細(xì)胞質(zhì)呈篩狀外觀，并伴隨不同程度的多聚核糖體丟失，導(dǎo)致粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒；線粒體腫脹，線粒體嵴突腫脹，嵴數(shù)量減少（圖11C）。小膠質(zhì)細(xì)胞包圍吞噬神經(jīng)元細(xì)胞，呈現(xiàn)嗜神經(jīng)現(xiàn)象（圖11D）。

對(duì)照組肺組織中I型上皮細(xì)胞扁平，其細(xì)胞核內(nèi)可見呈淺亮的常染色質(zhì)和呈深色顆粒狀的異染色質(zhì)，胞質(zhì)少而薄，胞漿內(nèi)可見少量細(xì)胞器，與周圍細(xì)胞連接緊密（圖12A）；肺組織中的II型上皮細(xì)胞核大而圓，常染色質(zhì)細(xì)密，異染色質(zhì)少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體、溶酶體等細(xì)胞器豐富（圖12B）；II型上皮細(xì)胞胞漿中可見清晰的特征性包含物——嗜鋨性板層小體（圖12C）。感染組肺組織中I型上皮細(xì)胞核中染色質(zhì)邊集，呈不規(guī)則堆積，并且與周圍細(xì)胞之間連接松弛（圖12D）；肺組織中II型上皮細(xì)胞核形狀不規(guī)則，染色質(zhì)邊集，核周細(xì)胞質(zhì)電子密度降低，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體、高爾基復(fù)合體等細(xì)胞器減少，胞質(zhì)出現(xiàn)細(xì)小空泡變（圖12E），嗜鋨性板層小體或出現(xiàn)排空現(xiàn)象，溶酶體增多（圖12F）；肺泡壁中的細(xì)胞成分增多，其中肺泡II型上皮細(xì)胞增生，發(fā)生了間質(zhì)性肺炎。

圖9. 骨骼肌的超微病理變化

圖注：A.對(duì)照組肌組織橫紋明顯，每條肌原纖維都可見清晰明帶和暗帶交替排列；B.對(duì)照組肌細(xì)胞胞漿內(nèi)可見線粒體內(nèi)外膜和嵴突結(jié)構(gòu)清晰；C.感染組肌肉橫紋消失，肌原纖維溶解，線粒體腫脹、空泡化；D.感染組肌組織線粒體腫脹，表現(xiàn)為內(nèi)室腫脹，嵴和膜結(jié)構(gòu)模糊。

圖10. 腦組織的超微病理變化

圖注：A.對(duì)照組腦組織神經(jīng)元細(xì)胞器豐富，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)，線粒體豐富；B.對(duì)照組腦組織神經(jīng)元中線粒體內(nèi)外膜和嵴突結(jié)構(gòu)清晰；C.對(duì)照組腦組織中有髓神經(jīng)纖維髓鞘電子密度均勻；D.感染組腦組織神經(jīng)元細(xì)胞器豐富，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)，線粒體豐富；E.感染組腦組織神經(jīng)元胞漿中可見少量空泡，部分線粒體內(nèi)室腫脹；F.感染組腦組織中有髓神經(jīng)纖維髓鞘發(fā)生小泡性分離，呈現(xiàn)泡狀改變。

圖11. 脊髓的超微病理變化

圖注：A.對(duì)照組脊髓前角神經(jīng)元常染色質(zhì)明顯，異染色質(zhì)少，細(xì)胞器豐富；B.對(duì)照組脊髓前角神經(jīng)元胞質(zhì)中線粒體豐富，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)；C.感染組脊髓前角神經(jīng)元中線粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，脫顆粒，尼氏小體消失，核周見微空泡形成；D.感染組中小膠質(zhì)細(xì)胞包圍吞噬脊髓前角神經(jīng)元，呈現(xiàn)嗜神經(jīng)現(xiàn)象。

圖12. 肺臟的超微病理變化

圖注：A.對(duì)照組肺組織中 I型上皮細(xì)胞扁平，可見常染色質(zhì)和異染色質(zhì)，可見少量細(xì)胞器；B.對(duì)照組肺組織中II型上皮細(xì)胞核大而圓，常染色質(zhì)細(xì)密，異染色質(zhì)少，細(xì)胞器豐富；C.對(duì)照組肺組織中可見清晰的嗜鋨性半層小體；D.感染組肺組織中I型上皮細(xì)胞核中染色質(zhì)邊集，呈不規(guī)則堆積，與周圍細(xì)胞之間連接松弛；E.感染組肺組織中II型上皮細(xì)胞核形狀不規(guī)則，染色質(zhì)邊集，細(xì)胞器減少；F.感染組肺組織中的II型上皮細(xì)胞胞質(zhì)細(xì)小空泡變，嗜鋨性板層小體排空，溶酶體增生。

H1PV為低于人間傳染病名錄三級(jí)安全風(fēng)險(xiǎn)的病原，人類感染風(fēng)險(xiǎn)低。

H1PV是大鼠必須排除的病原體，對(duì)動(dòng)物有致病性。會(huì)干擾其他實(shí)驗(yàn)研究。

鑒于此，此感染實(shí)驗(yàn)必須在BSL-2級(jí)以上的生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原學(xué)實(shí)驗(yàn)，在ABSL-2實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

3 腸道病毒71型輕癥小鼠模型各指標(biāo)檢測(cè)

3.1 輕癥EV71小鼠模型建立

采用EV71臨床分離株（NX10-36）病毒建立輕癥小鼠模型，用104.5 TCID50/ml的病毒滴度經(jīng)腹腔注射感染9日齡BALB/c乳鼠，6 dpi輕癥小鼠發(fā)生豎毛的臨床表現(xiàn)；對(duì)輕癥EV71小鼠模型連續(xù)觀察14天，繪制生存率（圖1A），體重增長(zhǎng)曲線（圖1B），臨床評(píng)分（圖1C）。所有小鼠存活到14 dpi，并且其體重增長(zhǎng)與空白對(duì)照組小鼠無(wú)差異（p > 0.05）。

3.2 輕癥小鼠模型各組織病毒載量檢測(cè)

為了進(jìn)一步探討輕癥EV71小鼠模型體內(nèi)病毒載量情況，采用RT-PCR對(duì)3 dpi和5 dpi輕癥小鼠腦、脊髓、骨骼肌、空腸和肺組織進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)（圖1D），發(fā)現(xiàn)以上各組織在3 dpi和5 dpi 均檢測(cè)到EV71病毒，其中，檢測(cè)到輕癥模型3 dpi骨骼肌中的高病毒載量（106.0 copies/mg），5 dpi病毒載量未見明顯增加，其中，3 dpi 在輕癥模型腦組織中均檢測(cè)到低病毒載量(102.0 copies/mg)，5 dpi腦組織中病毒載量均增加到104.0 copies/mg。3 dpi在輕癥模型脊髓、空腸和肺組織中的病毒載量在103.0 到104.0 copies/mg，5 dpi 病毒載量無(wú)明顯變化。輕癥小鼠模型中均檢測(cè)到骨骼肌和脊髓中較高的病毒載量，說(shuō)明這些組織是病毒復(fù)制并傳播到腦組織的重要部位。

圖1. EV71毒株（NX10-36）104.5 TCID50經(jīng)腹腔注射感染乳鼠建立輕癥小鼠模型的生存率、體重、臨床評(píng)分和組織內(nèi)病毒載量

A.生存率; B. 體重; C. 臨床評(píng)分; D. 各組織內(nèi)的病毒載量

3.3 輕癥小鼠模型組織病理學(xué)變化

運(yùn)用組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)技術(shù)，對(duì)輕癥小鼠模型的各組織器官進(jìn)行病理學(xué)觀察?？瞻讓?duì)照組小鼠未見明顯病理變化，并且EV71抗原呈陰性反應(yīng)。

對(duì)輕癥小鼠模型（NX10-36）組織病理學(xué)觀察（圖2），發(fā)現(xiàn)5dpi 小鼠后肢骨骼肌發(fā)生肌炎，多量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，主要有淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、少量嗜中性粒細(xì)胞，而3 dpi肌纖維之間見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肌細(xì)胞未發(fā)生壞死；3 dpi和5 dpi脊髓前角和腦干可見少量神經(jīng)元發(fā)生變性，可見血管源性水腫，在5 dpi脊髓神經(jīng)元尼氏小體消失（圖2-23C）；3dpi在肺臟和空腸中未見明顯病理學(xué)變化，5 dpi肺臟發(fā)生局灶性間質(zhì)性肺炎，間質(zhì)增寬，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔毛細(xì)血管淤血；5 dpi 空腸發(fā)生大面積黏膜上皮細(xì)胞空泡變性。免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在上述病變的組織中可觀察到EV71特異性抗原分布（圖3），在3 dpi和5dpi脊髓、腦干和骨骼肌檢測(cè)到較強(qiáng)的陽(yáng)性EV71抗原信號(hào)，而在肺和空腸組織中檢測(cè)到中等強(qiáng)度陽(yáng)性EV71抗原信號(hào)。

圖 2. 輕癥小鼠模型各組織的組織病理學(xué)檢測(cè)

圖注：9日齡BALB/c乳鼠腹腔注射104.5 TCID50 EV71毒株（NX10-36），3dpi和5dpi解剖取材，圖片顯示各組別的典型組織照片（×200），箭頭指示5dpi各組織典型病理變化，對(duì)照組小鼠組織未見明顯病理變化。

圖3. 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)輕癥小鼠模型各組織中的EV71VP2蛋白

圖注：輕癥小鼠的骨骼肌、脊髓、腦干、肺以及空腸組織中可檢測(cè)到陽(yáng)性EV71抗原（棕黃色顆粒）（×200），在空白對(duì)照組的上述組織中未見陽(yáng)性EV71抗原。

2.1實(shí)驗(yàn)材料

2.1.1 細(xì)胞株

橫紋肌瘤細(xì)胞（RD）。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)9日齡BALB/c乳鼠，每窩5 ~ 7只，母鼠自然哺乳。

2.1.3 病毒

EV71臨床分離株基本信息見表1。

表1. EV71臨床分離株基本信息

2.1.4 病毒培養(yǎng)與病毒TCID50的測(cè)定

RD細(xì)胞貼壁覆蓋細(xì)胞培養(yǎng)瓶生長(zhǎng)成單層后，分別接種EV71病毒株，24 hpi觀察細(xì)胞形態(tài)，待90%的細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞病變時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于–80℃冰箱中，并反復(fù)凍融3次后，經(jīng)離心后分裝病毒液并低溫保存。采用常規(guī)方法測(cè)定TCID50。在BSL-2實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。

2.2 輕癥EV71小鼠模型建立

根據(jù)前期結(jié)果確定攻毒量，建立輕癥EV71小鼠模型，9日齡BALB/c乳鼠輕度麻醉后，經(jīng)腹腔注射104.5 TCID50 EV71臨床分離株NX10-36(GenBank登錄號(hào)KJ004557)，攻毒劑量為250 μl/只；空白對(duì)照組乳鼠(n=12)腹腔注射等量RD細(xì)胞上清，其中3只取其血清作為對(duì)照組血清。在3 dpi和5 dpi每組各剖殺3只乳鼠，立即取其腦干、脊髓、肺臟、后肢骨骼肌和空腸固定在4 %多聚甲醛中，以備組織病理學(xué)檢測(cè)；同時(shí)，每組另剖殺3只乳鼠取以上組織凍存，以備病毒RNA提取和組織內(nèi)病毒載量測(cè)定。

2.3 輕癥EV71小鼠模型鑒定方式

輕癥EV71小鼠模型臨床癥狀主要表現(xiàn)為豎毛，不出現(xiàn)后肢癱瘓或死亡。

EV71小鼠模型臨床癥狀評(píng)分如表2所示。

表2. EV71小鼠模型臨床癥狀評(píng)分

1概述

1.1 腸道病毒71型手足口病概述

手足口病（hand, foot, and mouth disease, HFMD）是由腸道病毒引起的，以發(fā)熱和手、足、口腔、臀部等部位出現(xiàn)皮疹、皰疹或皰疹性咽峽炎為主要特征的一種常見于小兒的急性傳染病。手足口病多發(fā)生于入學(xué)前兒童，尤其是3歲以內(nèi)的嬰幼兒，腸道病毒71型（enterovirus71, EV71）是導(dǎo)致手足口病暴發(fā)的主要病原體，EV71 手足口病是急性自限性疾病，絕大多數(shù)病人會(huì)自然痊愈，少數(shù)患者會(huì)發(fā)展為重癥，并發(fā)無(wú)菌性腦膜炎、腦干腦炎、神經(jīng)源性肺水腫、急性弛緩性麻痹和心肌炎等，死亡率和致殘率較高。

1.2 EV71致病機(jī)理和病理特征

手足口病一般以發(fā)熱和手、足、口腔、臀部等部位出現(xiàn)皮疹、皰疹或皰疹性咽峽炎為主要特征。EV71主要通過(guò)糞口途徑傳播，病毒從咽部或胃腸道侵入人體內(nèi)，最初EV71病毒定植于鼻咽部或胃腸局部黏膜，出現(xiàn)皮疹、皰疹或皰疹性咽峽炎，侵入淋巴組織并在其中繁殖，若機(jī)體未能及時(shí)應(yīng)答產(chǎn)生足量的中和抗體以清除病毒，則病毒可進(jìn)一步進(jìn)入血液，引起第一次病毒血癥，若機(jī)體免疫力差，則EV71可進(jìn)一步擴(kuò)散入侵全身網(wǎng)狀內(nèi)皮組織、深層淋巴結(jié)、肝、脾、骨髓等組織器官，并大量繁殖，隨后再次入血，引起第二次病毒血癥，EV71最終可侵入靶器官細(xì)胞，如腦、腦膜、脊髓、心肌、橫紋肌以及皮膚黏膜等組織，引起重癥病變，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的嚴(yán)重?fù)p害。