1. 該模型鑒定和評價的技術(shù)方法和指標(biāo)體系，符合潰瘍性結(jié)腸炎的病理特點，尤其與潰瘍性結(jié)腸炎反復(fù)發(fā)作、遷延不愈的臨床特點高度相似。

（1） 疾病活動指數(shù)

（2） 結(jié)腸指數(shù)

（3） 結(jié)腸組織大體評分

（4） HE 染色病理觀察

（5） MPO 酶活性檢測

2. 與國內(nèi)外現(xiàn)有模型的異同

現(xiàn)有的潰瘍性結(jié)腸炎的造模方法有單一化學(xué)法刺激、免疫法、免疫復(fù)合法、基因修飾法。雖然現(xiàn)在建造UC動物模型的方法多種多樣，但是依舊存在著或多或少的缺陷。理想模型要簡單易操作，同時盡可能全面、準(zhǔn)確的模擬人類UC的病理生理學(xué)特點和表現(xiàn)，既要與自發(fā)的炎癥誘因相近，又要符合腸道炎癥進展、組織損傷進展等，同時模型病變盡量維持較長時間，能盡量反映慢性病變的過程和特點，以滿足實驗的需求。而目前尚缺乏能滿足這些要求的模型，且已有模型以急性損傷模型為主。故亟待尋找更好的，具有良好重復(fù)性、穩(wěn)定性，并且操作簡單的動物模型，從而為研究UC發(fā)病機制、研發(fā)治療新藥物提供良好的基礎(chǔ)。

3. 本研究的主要創(chuàng)新點或技術(shù)關(guān)鍵

3.1 創(chuàng)新點

本模型采用誘導(dǎo)劑聯(lián)用的方法，建立慢性、炎癥維持時間長且病程穩(wěn)定的小鼠慢性 UC 造模方法。該模型改進了傳統(tǒng)潰瘍性結(jié)腸炎模型的病程短、穩(wěn)定性差、模型指標(biāo)缺少特異性等問題，更大程度的模擬了臨床慢性潰瘍性結(jié)腸炎病理指標(biāo)。

3.2 關(guān)鍵技術(shù)

采用噁唑酮和2,4,6-三硝基苯磺酸兩種誘導(dǎo)劑聯(lián)用、致敏與感染相結(jié)合的方法，建立了新慢性、炎癥維持時間長且病程穩(wěn)定的小鼠慢性 UC 模型方法。

4. 可行性分析

4.1 前期摸索研究充分，通過閱讀大量中外文獻，較充分的了解潰瘍性結(jié)腸炎疾病以及模型建立過程中的問題。

4.2 實驗單位具備動物飼養(yǎng)許可證以及較先進的實驗器材和檢測設(shè)備。

4.3 通過閱讀大量中外文獻和走訪調(diào)研，噁唑酮和三硝基苯磺酸在臨床上應(yīng)用廣泛，效果明顯，具有可行性。

本實驗采用昆明種6-8周齡的健康成年小鼠，體重均在33±2g，SPF級。飼料墊料均為高壓滅菌產(chǎn)品，購自北京斯貝福生物科技股份有限公司，動物用水為實驗室制UP水經(jīng)過除菌處理。飼養(yǎng)及實驗操作均于具有檢驗合格資質(zhì)的SPF級屏障動物室內(nèi)進行，并且實驗動物以完整的包裝直接進入屏障實驗室，觀察室適應(yīng)7天后無異常情況，方可進行實驗。所有實驗中小鼠均引頸處死，盡量減少動物手術(shù)創(chuàng)傷程度及失血量。實驗過程中動物操作均符合動物倫理學(xué)規(guī)范，對環(huán)境和生態(tài)影響等符合國家相關(guān)法律規(guī)定。

1. 左肺彌漫性出血、滲出，而右肺損害不明顯。

Fig1 肺部大體解剖

2. 肺泡灌洗液白細(xì)胞計數(shù)和蛋白濃度、肺濕干重比結(jié)果見表3~5。I ) 鹽酸組與生理鹽水組比較，肺泡灌洗液中白細(xì)胞計數(shù)呈顯著增加；除30 min時間點， HCl組與相對應(yīng)的各個時間點NS組的比較，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，并在6 hHCl組達到峰值(P值＜0.01)。II ) 肺泡灌洗液蛋白濃度6 h NS組時BALF蛋白濃度出現(xiàn)輕度升高(P值＜0.05 vs 12 h組)；HCl刺激6 h時達峰值并明顯高于6 h NS組及其它時間點HCl 組。III )左肺肺濕干重比值(W/D)在HCl刺激30 min時明顯升高，12 h達峰值后呈下降趨勢，至24小時進一步恢復(fù)。

3. TNF-α、IL-6、IL-1β和NF-κB免疫印跡檢測

NS組各時間點組肺組織TNF-α、IL-6、IL-1β和NF-κB的蛋白表達量無顯著差異， HCl組6、12和24 h顯著升高( P值＜0.01 vs NS組)，在12 h HCl組達到峰值( P＜0.05 vs 6 h 、24 h HCl組，F(xiàn)ig2)；肺組織IL-6蛋白表達量比較HCl組30 min開始顯著升高( P＜0.01 vs NS組)， 6 h HCl組達到峰值( P＜0.01 vs NS組，P＜0.05 vs 30 min、24 h HCl組，F(xiàn)ig3)；肺組織IL-1β 蛋白表達量比較，HCl組30 min開始顯著升高( P＜0.05 vs NS組)，在6 h HCl組達到峰值( P＜0.05 vs NS組， P＜0.05 vs 2 h、24 h HCl組，F(xiàn)ig4)；肺組織NF-κB蛋白表達量比較，HCl組30 min開始升高，在2 h、6 h和12 h HCl組表達量顯著升高( P＜0.05 vs NS組，F(xiàn)ig5)。

4.病理學(xué)結(jié)果及肺損傷評分

NS組各時間點肺組織觀察可見肺泡結(jié)構(gòu)完整、清晰，無損害( Fig6 )；30 min HCl 組的肺組織未見明顯損害或輕微損害，肺泡結(jié)構(gòu)較完整, 肺泡間隔無明顯水腫，有少量炎性細(xì)胞浸潤( Fig6B)；2 h HCl組，彌漫性肺泡壁增厚、紅細(xì)胞滲出和炎性細(xì)胞浸潤( Fig6D黑色箭頭所示)；6 hHCl組，肺組織損害顯著，肺組織彌漫性的出血、水腫，肺泡壁增厚、結(jié)構(gòu)紊亂，部分肺泡萎陷不張( Fig6F黑色箭頭所示)；12 hHCl組較6 h HCl組損害程度減輕，肺間質(zhì)輕中度水腫，肺泡結(jié)構(gòu)破壞程度以及炎性細(xì)胞浸潤較6 h組減輕(Fig6H黑色箭頭所示)；24 hHCl組，肺組織水腫充血程度仍然較重，與6、12 h組相比肺部炎癥程度較輕( Fig6J黑色箭頭所示)。HCl 組與NS組各個時間刺激點相比較， (除外30 min) 的肺組織病理損傷評分顯著升高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)；并且HCl組，6 h HCl 組肺損傷評分與2 h、12 h HCl組比較顯著升高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值＜0.05)。

Fig6 小鼠肺病理學(xué)改變 (H&E染色 ×400)

Fig7 肺損傷評分 與NS組比較顯著升高 *P值＜0.001；6h組與2 h、12 h HCl組比較顯著升高 #P值＜0.05；

5. 肺組織免疫組化結(jié)果

CD3為T淋巴細(xì)胞膜表面標(biāo)記物，12 h HCl 組可見肺間質(zhì)出現(xiàn)T淋巴細(xì)胞(CD3+)(Fig8H)，24 h時仍大量存在(Fig8J)；以CD68為細(xì)胞膜表面標(biāo)記物的巨噬細(xì)胞，在6 h HCl 組的肺間質(zhì)出現(xiàn)( Fig9F)，至24 h時仍然大量存在(Fig9J)；Gr-1主要為粒細(xì)胞膜表面標(biāo)記物，30 min HCl 組開始在肺泡間質(zhì)出現(xiàn)，部分與肺泡壁黏附，至24 h時仍然大量存在(Fig10)。

Fig8 肺組織CD3免疫組化-T淋巴細(xì)胞 (×400)

Fig9 肺組織CD68免疫組化-巨噬細(xì)胞 (×400)

Fig10 肺組織Gr-1免疫組化-嗜中性粒細(xì)胞 (×400)

呼吸功能(Pehn)： HCl刺激小鼠6-12 h時出現(xiàn)Pehn明顯升高，提示起到阻力顯著增加

Tab 6 各組呼吸功能 Pehn(x±s)

*P值＜0.01 vs相應(yīng)時間點NS組; #P值＜0.05 vs 2 h組; ▲P值＜0.05 vs 24 h組

1. C57bL/6J小鼠 ，名稱：C57bL/6J，近交系（Inbred Rat）

品系來源 ：1921年 C.C.Little用 Lathrop小鼠作近親培育時，用No7雄鼠和No.52雌鼠交配，培育成C57。在C57中將毛色呈黑色的進行固定，培育成C57BL。1937年Ltle將維持的C57BL第六組亞系定名為C57BL6，將第十組亞系定名為C57BL10，繼而分別維持至今。1947年從 Little引入到美國 Jackson Lab，形成C57BL/6J:1951年從 Jackson Lab將第32代引入到NH，形成c57BL6N亞系；1974年 Charles River從NH引入并于1975年進行了剖腹產(chǎn)。六十年代從 Jackson Lab引入到日本實驗動物中央研究所,1986年自日本實驗動物中央研究所引入到中科院上海實驗動物中心。2001年中國北京維通利華從美國 Charles River引入第59代核心群。

2. 鹽敏感大對照鼠SS-13BN Rat，名稱：SS-Chr13BN/McwiCrlVr，?同類系（Consomic Rat）

3.誘導(dǎo)方法：自制氣管滴注導(dǎo)管，動脈導(dǎo)管( 內(nèi)徑0.28mm,427401, BD Intramedic PE Tubing)，長度4cm，插入端加熱制成一定弧度，動物麻醉后頸前暴露氣管，充分暴露喉部以及聲門，配合冷光源的使用，可見光源由聲門處透射出并隨聲門開合呈現(xiàn)閃爍感( Fig2A)；于聲門張開瞬間，右手持導(dǎo)管向前上方平穩(wěn)插入氣管，有輕微突破感，拔出導(dǎo)絲，調(diào)整導(dǎo)管向左側(cè)彎曲，緩慢向氣管深處插入，深至距小鼠上門牙約2.8cm以確保導(dǎo)管末端置于左主支氣管內(nèi)，末端連接胰島素注射器，向?qū)Ч軆?nèi)緩慢推注0.1M濃度鹽酸或生理鹽水對照），推注過程大于10s，再補推注入約30倍液體體積的空氣。豎直放置小鼠5min，術(shù)后小鼠給予保溫措施等待蘇醒，密切觀察至72h，存活動物為成功造模動物。

急性肺損傷(acute lung injury，ALI）是由非心源性的各種嚴(yán)重肺內(nèi)外致病因素如嚴(yán)重感染休克、創(chuàng)傷、DIC、誤吸等原發(fā)疾病引起，臨床主要表現(xiàn)為急性進行性加重的呼吸困難和難治性低氧血癥,進一步發(fā)展可演變?yōu)榧毙院粑狡染C合征(ARDS）[1]。雖然ALI的病因多樣，但研究顯示它們是嚴(yán)重?fù)p傷引起機體全身免疫炎癥反應(yīng)失控過程中的不同階段。而肺臟則是這一過程中最易受損的首位靶器官，所以ARDS出現(xiàn)最早發(fā)病率也最高。

正常的肺組織由肺泡上皮細(xì)胞和微血管內(nèi)皮兩大系統(tǒng)構(gòu)成良好的肺泡毛細(xì)血管的屏障。無論哪種原因的損傷通過氣道(直接肺損傷還是毛細(xì)血管(間接肺損傷))，而最終的結(jié)果是導(dǎo)致彌漫性的肺泡損傷[2]。當(dāng)直接肺損傷因素作用于肺時，損傷首先累及肺泡上皮并促使肺泡巨噬細(xì)胞和炎癥反應(yīng)鏈的激活，導(dǎo)致肺內(nèi)炎癥反應(yīng)，進而導(dǎo)致肺泡上皮的損傷。因此肺內(nèi)源性ARDS病理表現(xiàn)為以肺泡腔內(nèi)改變?yōu)橹饕鸱闻萸粌?nèi)水腫纖維蛋白、膠原蛋白滲出和中性粒細(xì)胞聚集，可合并肺泡內(nèi)出血導(dǎo)致肺實變。而當(dāng)間接肺損傷因素激活全身炎癥反應(yīng)肺外炎性介質(zhì)通過循環(huán)系統(tǒng)進入肺內(nèi)，肺作為全身炎癥反應(yīng)的靶器官引起進一步損傷的首先導(dǎo)致肺血管充血血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷血管通透性的增加及單核細(xì)胞淋巴細(xì)胞、多核細(xì)胞、血小板等炎性細(xì)胞的聚集，進而引起肺小血管的充血和肺間質(zhì)水腫導(dǎo)致肺泡萎陷，但肺泡腔的結(jié)構(gòu)一般正常。[3]利用小鼠HCl單側(cè)吸入性急性肺損傷模擬人類臨床急性肺損傷病變。