Armh4基因敲除小鼠模型，采用的是基于CRISPR/Cas9技術(shù)的完全性基因敲除（Conventional Knockout,KO）。完全性基因敲除是把敲除目的基因的所有外顯子或幾個(gè)總要的外顯子功能區(qū)敲除掉，獲得全身所有的組織和細(xì)胞中都不表達(dá)該基因的小鼠模型。Armh4基因敲除小鼠模型為完全性基因敲除模型（KO），該模型應(yīng)用范圍廣，可以制造針對(duì)各類疾病不同組織器官細(xì)胞的疾病模型。

CRISPR/Cas9技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于其對(duì)基因進(jìn)行定位的精準(zhǔn)編輯，在向?qū)NA（guide RNA，gRNA）和Cas9蛋白的共同作用下，細(xì)胞基因組DNA（被看成外源DNA）將被準(zhǔn)確剪切。但是，被CRISPR/Cas9剪切需要滿足幾個(gè)條件。第一，待編輯的區(qū)域附近需要存在相對(duì)保守的PAM序列（NGG）。第二，向?qū)NA要與PAM上游的序列堿基互補(bǔ)配對(duì)。

模型動(dòng)物飼養(yǎng)在武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物房SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特點(diǎn)

門采用專用凈化密閉門并配備觀察窗。單向走道呈順時(shí)針走向設(shè)計(jì)。屏障系統(tǒng)內(nèi)共有大鼠飼養(yǎng)室1間，小鼠飼養(yǎng)室3間，隔離觀察室1間，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室1間，潔物存放室1間，清洗消毒室1間。此外，屏障系統(tǒng)外配有監(jiān)控室、機(jī)房和配電室等。

（2）設(shè)計(jì)參數(shù)

室內(nèi)溫度：20～26°C；日溫差：≤4°C；相對(duì)濕度：40%～70%；換氣次數(shù)：15～20次/h；氣流速度：≤0．2m/s；壓強(qiáng)梯度：20～50Pa；空氣潔凈度：7級(jí)；菌落數(shù)：≤3個(gè)/皿；氨濃度：≤14mg/m3；噪聲：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；動(dòng)物照度：15～20lx；晝夜明暗交替時(shí)間：12/12h。

（3）通風(fēng)和空調(diào)系統(tǒng)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室采用全新風(fēng)中央空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)。空氣經(jīng)過初、中、三級(jí)過濾器后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室內(nèi)環(huán)境。

（4）照明系統(tǒng)

一更、淋浴、二更、氣閘、清潔走道、潔物存放處、污物走道、緩沖間和清洗消毒間、動(dòng)物飼養(yǎng)室、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備間、隔離觀察室和功能實(shí)驗(yàn)室等安裝有手動(dòng)和自動(dòng)開關(guān)，根據(jù)實(shí)際需要，調(diào)節(jié)控制室內(nèi)照明燈。未啟用房間、清潔走道、潔物存放處、污物走道等在每日中午12點(diǎn)和晚上8點(diǎn)開啟紫外線燈照射1h。

（5）通訊系統(tǒng)

因?yàn)镾PF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境和設(shè)施具有特殊要求，人員進(jìn)入后不能隨意出入，而室內(nèi)外的聯(lián)系又十分重要，故室內(nèi)各房間均安裝內(nèi)部電話機(jī)，按照房間順序編排電話號(hào)碼，各室內(nèi)電話可相互連通，并均與監(jiān)控室總機(jī)保持聯(lián)系，保證實(shí)驗(yàn)室內(nèi)外信息的及時(shí)溝通。

（6）監(jiān)控系統(tǒng)

對(duì)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的出入口、走道、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)室、功能操作室等重要位置均安裝了可作270°旋轉(zhuǎn)的攝像機(jī)，能夠及時(shí)了解設(shè)施的運(yùn)行狀態(tài)；也能有效督促實(shí)驗(yàn)人員執(zhí)行科學(xué)的操作規(guī)程，避免人為因素造成室內(nèi)環(huán)境和設(shè)施的污染；并對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間的動(dòng)物狀態(tài)和反應(yīng)進(jìn)行觀察，減少對(duì)動(dòng)物的滋擾。

（7）供水系統(tǒng)

SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲用水以純凈水為宜。本實(shí)驗(yàn)室采用管道供水，將處理后的純凈水用塑膠管道輸送到屏障系統(tǒng)內(nèi)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室，設(shè)置接水槽，為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)滅菌的飲用水和屏障系統(tǒng)內(nèi)用水。要經(jīng)常更換和清洗輸水管道，清洗籠具的用水添加適當(dāng)比例的84消毒液。

（8）供電系統(tǒng)、警報(bào)系統(tǒng)和消防設(shè)施

SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室要求全天候不間斷供風(fēng)和供電，如果出現(xiàn)故障，不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)和處理，就可能導(dǎo)致環(huán)境設(shè)施的污染、動(dòng)物感染或死亡，造成嚴(yán)重后果。因此應(yīng)對(duì)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室使用獨(dú)立穩(wěn)定的供電系統(tǒng)，并配備有應(yīng)急電源。在中央空調(diào)機(jī)房控制室安裝風(fēng)機(jī)故障警報(bào)系統(tǒng)，以便及時(shí)檢修和維護(hù)，保證設(shè)施的安全運(yùn)行。

（9）消毒滅菌設(shè)備

為防止外界物品進(jìn)入SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室時(shí)所攜帶的細(xì)菌污染室內(nèi)環(huán)境和造成動(dòng)物交叉感染，按照不同物品的特性，進(jìn)行紫外線照射消毒、渡槽消毒液消毒或?qū)Ｓ玫臋C(jī)動(dòng)門真空滅菌器消毒。

（10）動(dòng)物飼養(yǎng)籠具

飼養(yǎng)大、小鼠的籠具聚碳酸脂材料的塑膠籠具，具有高透明、耐高壓、耐高溫、耐酸堿等特點(diǎn)。通用的不銹鋼籠具長(zhǎng)、寬、高分別為40、30、20cm，適用于單籠飼養(yǎng)有特殊要求的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，配有底盤和食槽，確保實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有充足的采食和活動(dòng)空間，同時(shí)也保證室內(nèi)環(huán)境的清潔。

（11）墊料的選擇和使用

在使用塑膠墊料時(shí)，墊料是大小鼠直接接觸的鋪墊物，起到吸濕、保暖和造窩的作用。墊料的好壞直接影響到大小鼠術(shù)后的恢復(fù)、生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖性能。目前，所使用的墊料主要有玉米秸墊料、刨花墊料。

（12）飼料配制

大小鼠的生產(chǎn)型飼料和維持型飼料必須嚴(yán)格按照國家標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行科學(xué)配制生產(chǎn)。每半年檢測(cè)一次飼料的微生物指標(biāo)和有效營養(yǎng)成分指標(biāo)，保證飼料的質(zhì)量。

1. 鑒定PCR結(jié)果圖解 我們通過PCR都小鼠進(jìn)行了鑒定，如圖1，目前已經(jīng)得到純和子。

圖1：ArmH4 KO小鼠鑒定PCR結(jié)果圖。WT：407bp的條帶；HOMO：255bp的條帶；HET：407bp、255bp的條帶。2. Armh4在PE誘導(dǎo)的新生大鼠心肌細(xì)胞肥大水平的作用

通過PE誘導(dǎo)構(gòu)建新生大鼠心肌細(xì)胞肥大模型。qRT-PCR結(jié)果顯示，過表達(dá)Armh4心肌肥厚標(biāo)志物ANP、BNP表達(dá)量升高，表明過表達(dá)Armh4基因加重心肌肥厚（圖2）。而敲低Armh4后結(jié)果顯示，ANP、BNP表達(dá)量降低，表明敲低Armh4后減輕心肌肥厚（圖2）。

圖2.在新生大鼠心肌細(xì)胞中，分別過表達(dá)和敲除ArmH4基因?qū)E所誘導(dǎo)的心肌肥厚水平的影響。

野生型的八周齡年輕小鼠與22個(gè)月的衰老小鼠的心臟qRT-PCR結(jié)果表明，Armh4 mRNA水平顯著升高（圖3）。結(jié)合Armh4對(duì)心肌肥厚的影響，我們推測(cè)過表達(dá)Armh4會(huì)加速健康心臟衰老。

圖3.ArmH4在年輕小鼠和衰老小鼠中的mRNA表達(dá)水平。

1.項(xiàng)目設(shè)計(jì): 利用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行ARMH4 基因敲除小鼠構(gòu)建。在共同的exon2的附近設(shè)計(jì)以NGG結(jié)尾的靶點(diǎn)，在CRISPR/Cas9作用下進(jìn)行切割。

2．guideRNA信息:

Armh4 -sgRNA1：ATGGGAACTACTGTCGTTCCTGG

Armh4 -sgRNA2：CAACAGCTGGCAGTATTTTGGGG

3.構(gòu)建PE誘導(dǎo)的心肌肥大細(xì)胞模型，檢測(cè)ArmH4敲低后心肌肥厚分子標(biāo)志物水平，分別提取總RNA，通過qRT-PCR檢測(cè)心肌肥厚指標(biāo)ANP、BNP的mRNA水平。

4. 取野生型的八周齡年輕小鼠與22個(gè)月的衰老小鼠的心，通過qRT-PCR檢測(cè)Armh4 mRNA水平。

一、疾病概述 肥厚型心肌病 ( Hypertrophic cardiomyopathy) 是一種器質(zhì)性心臟疾病，主要表現(xiàn)為左心室和(或)右心室及室間隔不對(duì)稱肥厚、心室腔變小、心室順應(yīng)性降低。病因：肥厚型心肌病是常染色體顯性遺傳性疾病，60%～70%為家族性，30%～40%為散發(fā)性，家族性病例和散發(fā)病例、兒童病例和成年病例具有同樣的致病基因突變。 臨床表現(xiàn)： 1.以青壯年多見、常有家族史。 2.可以無癥狀，也可以有心悸、勞力性呼吸困難、心前區(qū)悶痛、易疲勞、暈厥甚至猝死，晚期出現(xiàn)左心衰的表現(xiàn)。 3.梗阻性肥厚型心肌患者胸骨左緣可出現(xiàn)粗糙的收縮中晚期噴射性雜音，可伴震顫，應(yīng)用洋地黃制劑、硝酸甘油、靜點(diǎn)異丙腎上腺素及Valsalva動(dòng)作后雜音增強(qiáng)，反之應(yīng)用β受體阻滯劑、去甲腎上腺素、下蹲時(shí)雜音減弱。有些病人聞及S3及S4心音及心尖區(qū)相對(duì)性二尖瓣關(guān)閉不全的收縮期雜音。 臨床診斷：超聲心動(dòng)圖提示左心室壁或（和）室間隔厚度≥15mm，排除了其他引起心肌肥厚的原因如高血壓病、風(fēng)濕性心臟病二尖瓣病、先天性心臟病（房間隔、室間隔缺損）及代謝性疾病伴發(fā)心肌肥厚。 二、模型背景1、Armh4基因信息? 敲除基因名稱（NCBI號(hào)）：67419? 敲除基因NCBI網(wǎng)址鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/67419? 敲除基因名稱（MGI號(hào)）：Armh4（MGI: 1914669）? 敲除基因Ensembl網(wǎng)址鏈接：http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Transcript/Summary?db=core;g=ENSMUSG00000036242;r=14:49675952-49783383;t=ENSMUST00000036972? 方案針對(duì)的轉(zhuǎn)錄本（Ensembl號(hào)）：ENSMUST00000036972.13? 方案敲除的exon：exon 22、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背景信息 所采用的小鼠品系為C57BL/6。 來源：1921年立特(Little)用艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop)的小鼠株，雌鼠57號(hào)與雄鼠52號(hào)交配而得C57BL1937年從C57BL分離出C57BL/6和C57BL/10兩個(gè)亞系。1985年從Olac引到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。 毛色：黑色。

主要特性：①乳腺腫瘤自然發(fā)生率低，化學(xué)物質(zhì)難以誘發(fā)乳腺和卵巢腫瘤。②12%有眼睛缺損;雌仔鼠16.8%，雄仔鼠3%為小眼或無眼。用可的松可誘發(fā)腭裂，其發(fā)生率達(dá)20%。③對(duì)放射物質(zhì)耐受力中等;補(bǔ)體活性高;較易誘發(fā)免疫耐受性。④對(duì)結(jié)核桿菌敏感。對(duì)鼠痘病毒有一定抵抗力。⑤干擾素產(chǎn)量較高。⑥嗜酒精性高，腎上腺素類脂質(zhì)濃度低。對(duì)百日咳組織胺易感因子敏感。⑦常被認(rèn)作"標(biāo)準(zhǔn)"的近交系，為許多突變基因提供遺傳背景。

主要用途：是腫瘤學(xué)、生理學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)研究中常用的品系。3、研究背景 該動(dòng)物模型的研究目的及意義；該動(dòng)物模型的國內(nèi)外研究進(jìn)展并附參考文獻(xiàn)。 肥厚型心肌病 ( Hypertuophic cardiomyopathy, HCM) 是一種器質(zhì)性心臟疾病，主要表現(xiàn)為左心室和( 或) 右心室及室間隔不對(duì)稱肥厚、心室腔變小、心室順應(yīng)性降低1。具有獨(dú)特的病理生理特征和多種形態(tài)、功能和臨床特征2。已有研究證明，HMC是常染色體顯性遺傳性疾病，60%～70%為家族性，30%～40%為散發(fā)性。雖然很多人認(rèn)為肥厚性心機(jī)病是一種相對(duì)不常見的心臟疾病，但有研究表明，從以社區(qū)為基礎(chǔ)的普通人群中選擇的一大批明顯健康的年輕人中，超聲心動(dòng)圖結(jié)果判定的HCM，發(fā)病率高達(dá)0.2% 2。HMC最常見發(fā)生于10到25歲之間的青年人，是年輕、健康的個(gè)人和運(yùn)動(dòng)員猝死的主要原因2。當(dāng)然心肌肥厚不僅涉及肥厚性心肌病，也是心力衰竭過程中代償性機(jī)制的體現(xiàn)。 衰老，系指隨著時(shí)間的增加，生命體功能衰退的過程3。壽命長(zhǎng)用做低等模式生物評(píng)價(jià)衰老最重要的指標(biāo)；而在高等動(dòng)物中，細(xì)胞、組織與器官結(jié)構(gòu)與功能復(fù)雜，單純用壽命作為衰老的唯一指標(biāo)并無全面，有研究認(rèn)為，改善衰老相關(guān)疾病被認(rèn)為是減輕衰老的表現(xiàn)4,5。衰老相關(guān)的系統(tǒng)性疾病包括：心腦血管疾病、腫瘤、骨關(guān)節(jié)炎、糖尿病與神經(jīng)退行性疾??；相關(guān)研究也通常會(huì)記錄衰老相關(guān)疾病的狀態(tài)來評(píng)價(jià)個(gè)體衰老的情況6。在與年齡增長(zhǎng)有關(guān)的疾病和失調(diào)中，最使人衰弱的疾病之一是喪失正常的心功能，從而導(dǎo)致心力衰竭7。左心室肥厚是心臟衰老的重要特征，可導(dǎo)致舒張功能不全和心力衰竭8。從逆轉(zhuǎn)心肌肥厚的角度，探究是否能夠減緩衰老的發(fā)生和發(fā)展。 β-連環(huán)蛋白（β-catenin）包含重復(fù)的~ 42個(gè)氨基酸序列,稱為犰狳(Armadillo)重復(fù),折疊在一起形成一個(gè)單一的、剛性的犰狳域(Armadillo domain, ARM)。含有ARM的蛋白質(zhì)通?？梢越Y(jié)合與細(xì)胞骨架構(gòu)成相關(guān)的蛋白，如細(xì)胞接觸和細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，以及通過產(chǎn)生和轉(zhuǎn)導(dǎo)影響基因表達(dá)信號(hào)的傳導(dǎo)功能9。ARM蛋白是一個(gè)龐大而多樣的家族，包含犰狳重復(fù)或犰狳樣螺旋結(jié)構(gòu)域。我們篩選出的Armh4(Armadillo-like helical domain containing 4)為暫未明確特征的編碼小鼠蛋白基因。與有文獻(xiàn)報(bào)道Armh4在成人造血系統(tǒng)惡性腫瘤,通過抑制mTORC2的激酶活性，進(jìn)一步負(fù)向調(diào)控STAT3信號(hào)通路，從而發(fā)揮抑制造血系統(tǒng)惡性腫瘤的作用10。另有研究報(bào)道，Armh4與心臟的發(fā)生有關(guān)11，Armh4是FHF（first heart field）和SHF（second heart field）心肌細(xì)胞衍生物的特異性標(biāo)記物?？傮w上，目前關(guān)于Armh4的研究較少。 本研究通過在NRVM上過表達(dá)、敲低Armh4發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Armh4加重心肌肥厚，敲低改善心肌肥厚，并且對(duì)比年輕小鼠與衰老小鼠Armh4的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)在衰老小鼠中Armh4的mRNA水平是上升的。而目前尚未報(bào)道Armh4在心肌肥厚發(fā)生過程中的作用，因此本項(xiàng)目擬探究Armh4對(duì)心肌肥厚的影響及探究其潛在的分子機(jī)制，為進(jìn)一步治療心肌肥厚相關(guān)疾病尋找治療靶點(diǎn)；同時(shí)也探究Armh4對(duì)衰老的影響，是否存在通過對(duì)Armh4干預(yù)，延緩衰老。參考文獻(xiàn)：1 Dadson, K., Hauck, L. & Billia, F. Molecular mechanisms in cardiomyopathy. Clin Sci (Lond) 131, 1375-1392, doi:10.1042/CS20160170 (2017).2 Maron, B. J. & Maron, M. S. Hypertrophic cardiomyopathy. The Lancet 381, 242-255, doi:10.1016/s0140-6736(12)60397-3 (2013).3 Lopez-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M. & Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell 153, 1194-1217, doi:10.1016/j.cell.2013.05.039 (2013).4 Kaeberlein, M., McVey, M. & Guarente, L. The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms %J Matt Kaeberlein;Mitch McVey;Leonard Guarente. 13 (1999).5 Rogina, B., Helfand, S. L. & Ames, B. N. Sir2 Mediates Longevity in the Fly through a Pathway Related to Calorie Restriction %J Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (2004).6 Childs, B. G. et al. Senescent cells: an emerging target for diseases of ageing. Nat Rev Drug Discov 16, 718-735, doi:10.1038/nrd.2017.116 (2017).7 Schocken, D. D. et al. Prevention of heart failure: a scientific statement from the American Heart Association Councils on Epidemiology and Prevention, Clinical Cardiology, Cardiovascular Nursing, and High Blood Pressure Research; Quality of Care and Outcomes Research Interdisciplinary Working Group; and Functional Genomics and Translational Biology Interdisciplinary Working Group. Circulation 117, 2544-2565, doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.107.188965 (2008).8 Lakatta, E. G. & Levy, D. Arterial and cardiac aging: major shareholders in cardiovascular disease enterprises: Part II: the aging heart in health: links to heart disease. Circulation 107, 346-354, doi:10.1161/01.cir.0000048893.62841.f7 (2003).9 Tewari, R., Bailes, E., Bunting, K. A. & Coates, J. C. Armadillo-repeat protein functions: questions for little creatures. Trends Cell Biol 20, 470-481, doi:10.1016/j.tcb.2010.05.003 (2010).10 Lee, D. et al. Endogenous transmembrane protein UT2 inhibits pSTAT3 and suppresses hematological malignancy. J Clin Invest 126, 1300-1310, doi:10.1172/JCI84620 (2016).11 Conway, S. J., McConnell, R., Simmons, O. & Snider, P. L. Armadillo-like helical domain containing-4 is dynamically expressed in both the first and second heart fields. Gene Expression Patterns 34, doi:10.1016/j.gep.2019.119077 (2019).