為了研究Npsn在斑馬魚中性粒細(xì)胞中的功能，我們運(yùn)用CRISPER/Cas9技術(shù)對斑馬魚npsn進(jìn)行全基因組敲除，并且獲得了一系列npsn基因發(fā)生移碼突變的突變體斑馬魚，比如在exon5-Cas9靶點(diǎn)獲得的（-7，+0）（npsnsmu5）突變體，和在exon6-Cas9靶點(diǎn)處獲得的（-0，+1）（npsnsmu6）突變體，并且經(jīng)預(yù)測它們的蛋白結(jié)構(gòu)相對于野生型斑馬魚出現(xiàn)移碼突變和提前終止。但是我們通過WISH檢測發(fā)現(xiàn)在npsnsmu5突變體斑馬魚中，npsn的信號(hào)幾乎是缺失的，并且qRT-PCR結(jié)果也同樣證明了在npsnsmu5突變體中npsn的mRNA水平下降到野生型斑馬魚的5%左右，可能是由npsn的無義突變導(dǎo)致了mRNA的全面降解所導(dǎo)致的。但是npsnsmu5純合突變體胚胎能夠正常存活到成年，大小和體型正常，并且是可以正常的產(chǎn)生后代。

為了研究Npsn缺陷是否影響斑馬魚中性粒細(xì)胞的發(fā)育，我們通過斑馬魚中性粒細(xì)胞特異性標(biāo)記基因mpx和lyz的整體原位雜交，發(fā)現(xiàn)npsnsmu5突變體和野生型斑馬對比，mpx+和lyz+信號(hào)點(diǎn)的數(shù)量沒有明顯差別。蘇丹黑染色也同樣發(fā)現(xiàn)SB+陽性細(xì)胞的數(shù)量也沒有差異。并且進(jìn)一步在DIC下觀察npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚中性粒細(xì)胞中的顆粒，也未發(fā)現(xiàn)明顯區(qū)別。以上結(jié)果表明，Npsn缺陷并不顯著影響斑馬魚中性粒細(xì)胞的發(fā)育和數(shù)量。這可能是因?yàn)镹psn只是斑馬魚中性粒細(xì)胞中的一種酶顆粒，缺失后并不影響中性粒細(xì)胞的發(fā)育，但是可能影響了中性粒細(xì)胞的某些功能。

為了研究Npsn缺陷對斑馬魚中性粒細(xì)胞功能的影響，而中性粒細(xì)胞的主要功能是參與機(jī)體的固有免疫反應(yīng)，因此我們做了斑馬魚大腸桿菌的侵染實(shí)驗(yàn)。我們利用顯微注射的方式感染npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚胚胎的卵黃囊，通過記錄并比較感染后兩者的生存率，發(fā)現(xiàn)npsnsmu5突變體在感染大腸桿菌后生存率相對于野生型胚胎顯著下降，體內(nèi)殘余的菌量明顯上升，并且在感染的早期階段，npsnsmu5突變體中炎性因子的表達(dá)水平比野生型明顯升高，這說明了中性粒細(xì)胞在抵抗細(xì)菌感染中存在功能缺陷。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Npsn在中性粒細(xì)胞抵抗感染中的作用，我們通過構(gòu)建斑馬魚Npsn過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因系Tg(hsp:Myc-npsn)，并且同時(shí)感染大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)Npsn過表達(dá)后能顯著提高感染后斑馬魚的存活率。這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步表明，斑馬魚Npsn有助于斑馬魚抵抗細(xì)菌感染。

但是Npsn通過哪種方式來幫助中性粒細(xì)胞抵抗感染的呢？先前有體外實(shí)驗(yàn)證明，鯉魚的Npsn能夠水解纖連蛋白和明膠，而這兩種組分又是細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分，那么Npsn是否通過影響斑馬魚中性粒細(xì)胞的遷移來影響對大腸桿菌的抵抗的呢？為了驗(yàn)證這個(gè)觀點(diǎn)，我們觀察了在感染后4小時(shí)時(shí)傷口處中性粒細(xì)胞的數(shù)量，但是比較npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚并沒有發(fā)現(xiàn)明顯差異。另外，Npsn作為一種水解酶，它能否能夠直接水解和破壞大腸桿菌細(xì)胞的完整性，進(jìn)而影響大腸桿菌在機(jī)體內(nèi)存活的呢？并且Npsn缺陷主要影響斑馬魚清除哪種類型的菌呢？為了驗(yàn)證這些問題，我們也將npsnsmu5突變體斑馬魚和野生型斑馬魚同時(shí)感染了其他類型的菌，如革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌銅綠假單胞菌等，發(fā)現(xiàn)Npsn缺陷后可能增加斑馬魚對革蘭氏陰性菌的敏感性。但是Npsn影響斑馬魚中性粒細(xì)胞抵抗細(xì)菌感染的具體機(jī)制，還需要更多的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。另外npsnsmu5突變體可以作為斑馬魚免疫與炎癥反應(yīng)模型，對研究在感染過程中，中性粒細(xì)胞與病原菌的相互關(guān)系，以及對研發(fā)新的抗菌藥物具有重要的指導(dǎo)意義。

動(dòng)物模型的制備和應(yīng)用實(shí)驗(yàn)必須在具備相應(yīng)資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室開展。動(dòng)物模型的制備、應(yīng)用過程中的監(jiān)督管理、處置措施、對環(huán)境和生態(tài)影響等應(yīng)符合國家相關(guān)法律規(guī)定。

1．中性粒細(xì)胞的形態(tài)及生化特征

原始中性粒細(xì)胞的發(fā)育首先由髓系祖細(xì)胞經(jīng)譜系決定，發(fā)育成粒細(xì)胞前體細(xì)胞，再由粒細(xì)胞前體細(xì)胞經(jīng)過增殖，分化和成熟形成有功能的中性粒細(xì)胞。在斑馬魚中，區(qū)分中性粒細(xì)胞可通過以下形態(tài)學(xué)與細(xì)胞學(xué)方法[1,2]：（1）成熟的中性粒細(xì)胞最顯著的形態(tài)學(xué)特征為含有分葉核以及大量顆粒的細(xì)胞質(zhì)，可以在循環(huán)系統(tǒng)以及結(jié)締組織中被很清晰地辨認(rèn)。（2）還可以通過分子標(biāo)記來分辨不同成熟時(shí)期的中性粒細(xì)胞。已經(jīng)有研究報(bào)道的粒細(xì)胞特異分子標(biāo)記有轉(zhuǎn)錄因子C/ebp1，粒細(xì)胞顆粒中含有的髓過氧化物酶（Mpx）、溶菌酶C（Lyz）等。（3）另外，還可通過檢測細(xì)胞的激活、趨化、變形運(yùn)動(dòng)能力、及吞噬、殺菌作用來辨別。（4）此外中性粒細(xì)胞可被蘇丹黑B（Sudanblack B，SB）特異性染色，并且可根據(jù)染色程度來辨別不同分化過程的中性粒細(xì)胞。

2．中性粒細(xì)胞與病原菌感染

中性粒細(xì)胞是一種具有多形核的白細(xì)胞，是人體固有免疫中的重要組成成分，在機(jī)體抵抗病原菌感染時(shí)起著重要的作用。中性粒細(xì)胞在體內(nèi)含量豐富，大約占人體白細(xì)胞總數(shù)的40%-75%[3]，并且在機(jī)體遭受病原菌感染時(shí)，中性粒細(xì)胞能夠迅速的從血管中遷移到感染部位[4]。當(dāng)中性粒細(xì)胞到達(dá)感染處后，主要通過兩種方式來抵抗感染，一種是分泌大量的細(xì)胞因子和趨化因子，比如IL-1b[5], IL-18[6], LL-37[7] ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA 等，這些小分子能夠招募和激活更多的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞到達(dá)感染部位，共同抵抗感染。另一方面，中性粒細(xì)胞還能夠直接吞噬和消化病原菌，這主要依賴于斑馬魚中性粒細(xì)胞中含有豐富的顆粒酶。中性粒細(xì)胞內(nèi)含有多種顆粒，這些顆粒富含各種殺菌作用的蛋白，并且在終末分化完成之前各種富含不同組分的顆粒必須組裝完成（如圖1所示）。中性粒細(xì)胞中三種顆粒分別是（1）嗜天青顆粒：又稱初級(jí)顆粒，在早幼粒細(xì)胞中數(shù)量最多，顆粒中含有髓過氧化物酶、溶菌酶及較多的水解酶。（2）特異顆粒：又稱次級(jí)顆粒，其中含有乳鐵蛋白、溶菌酶等，顆粒膜上有多種CD抗原和受體。（3）白明膠酶顆粒：含白明膠酶、溶菌酶[8]。這些顆粒主要通過兩種方式來殺滅病原菌。一種是氧依賴性殺菌途徑，主要通過激活膜結(jié)合成分NADPH系統(tǒng)，產(chǎn)生大量的活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）來直接氧化并殺死病原菌[9]；另一種方式是通過氧非依賴性方式來消化破壞病原菌的細(xì)胞膜或壁結(jié)構(gòu)的完整性[10,11]，從而通過使病原菌失去滲透壓而死亡。但是目前對這些顆粒酶的研究大多數(shù)是在體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的，大部分顆粒酶的體內(nèi)功能是未知的。因此了解和研究這些顆粒酶的成分以及顆粒酶的功能有助于研發(fā)新的抗菌酶。

圖1. 中性粒細(xì)胞中所含的顆粒酶種類，引用自Borregaard 等[12]。

3．斑馬魚Npsn蛋白的簡介

Npsn最早在鯉魚（Cyprinus carpio）的淋系造血組織中發(fā)現(xiàn)，屬于蝦紅素蛋白家族（astacinfamily）的一員，并且具有肽鏈內(nèi)切酶活性[13]。蝦紅素蛋白家族屬于金屬鋅蛋白酶超家族的一員，在蛋白質(zhì)消化、個(gè)體背腹軸確定以及形態(tài)發(fā)生中起著重要的作用[14]。研究者通過對比鯉魚的Npsn的蛋白序列與其他物種的同蛋白家族酶的相似性，發(fā)現(xiàn)Npsn與medaka的孵化酶有大于50%的序列相似性，但是作者并沒有在鯉魚的孵化液中檢測到Npsn的存在，所以作者猜測Npsn可能沒有孵化酶的活性。而關(guān)于Npsn的另一個(gè)研究是在斑馬魚中進(jìn)行的，作者通過分析斑馬魚造血組織的ESTs序列以及整體原位雜交（Whole-mount In Situ Hybridization, WISH）實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了三個(gè)新的特異性表達(dá)在斑馬魚血管以及造血組織中的基因，Npsn就是其中的一個(gè)[15]。并且作者通過雙色原位雜交進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Npsn可能表達(dá)在斑馬魚的中性粒細(xì)胞中。根據(jù)以上前人的研究，我們猜測，Npsn可能是斑馬魚中性粒細(xì)胞中的一種顆粒酶，然而 Npsn在中性粒細(xì)胞中的作用，以及是否參與到宿主先天免疫至今尚未有研究。

4．斑馬魚在作為研究中性粒細(xì)胞顆粒酶功能的模式生物中的優(yōu)越性

近幾十年來，斑馬魚逐漸成為一種強(qiáng)大的工具來研究感染類疾病，除了斑馬魚的傳統(tǒng)優(yōu)勢外，在研究中性粒細(xì)胞和病原菌的相互關(guān)系中具有獨(dú)特的優(yōu)勢。首先，斑馬魚中性粒細(xì)胞的發(fā)育過程是保守的，都是起源于造血干細(xì)胞，通過早幼粒、中幼粒最終發(fā)育成為成熟的帶有分頁核的粒細(xì)胞[12]。其次，斑馬魚中成熟的轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以用熒光蛋白標(biāo)記中性粒細(xì)胞，進(jìn)而在活體實(shí)時(shí)觀察中性粒細(xì)胞對病原菌的響應(yīng)以及吞噬病原菌的過程[16]。第三，利用微分干涉相差顯微鏡顯微鏡（DIC）可以清晰看到中性粒細(xì)胞所含的顆粒酶，以及顆粒酶的發(fā)育過程。

參考文獻(xiàn)

[1] Le Guyader D,Redd MJ, Colucci-Guyon E, et al. Origins and unconventional behavior ofneutrophils in developing zebrafish[J]. Blood, 2008,111(1):132-41.

[2] Jin H, Li L, Xu J,et al. Runx1 regulates embryonic myeloid fate choice in zebrafish through anegative feedback loop inhibiting Pu.1 expression[J]. Blood,2012,119(22):5239-49.

[3] Witko-Sarsat V,Rieu P, Descamps-Latscha B, et al. Neutrophils: molecules, functions andpathophysiological aspects[J]. Lab Invest, 2000,80(5):617-53.

[4] Amulic B, CazaletC, Hayes GL, et al. Neutrophil function: from mechanisms to disease[J]. AnnuRev Immunol, 2012,30:459-89.

[5] Dinarello CA.Biologic basis for interleukin-1 in disease[J]. Blood, 1996,87(6):2095-147.

[6] Wawrocki S,Druszczynska M, Kowalewicz-Kulbat M, et al. Interleukin 18 (IL-18) as a targetfor immune intervention[J]. Acta Biochim Pol, 2016,63(1):59-63.

[7] Stephan A,Batinica M, Steiger J, et al. LL37:DNA complexes provide antimicrobial activityagainst intracellular bacteria in human macrophages[J]. Immunology,2016,148(4):420-32.

[8] Faurschou M,Borregaard N. Neutrophil granules and secretory vesicles in inflammation[J].Microbes Infect, 2003,5(14):1317-27.

[9] Dinauer MC,Lekstrom-Himes JA, Dale DC. Inherited Neutrophil Disorders: Molecular Basis andNew Therapies[J]. Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 2000:303-18.

[10] Spitznagel JK,Shafer WM. Neutrophil killing of bacteria by oxygen-independent mechanisms: ahistorical summary[J]. Rev Infect Dis, 1985,7(3):398-403.

[11] Shafer WM, KatzifS, Bowers S, et al. Tailoring an antibacterial peptide of human lysosomalcathepsin G to enhance its broad-spectrum action against antibiotic-resistantbacterial pathogens[J]. Curr Pharm Des, 2002,8(9):695-702.

[12] Borregaard N.Neutrophils, from marrow to microbes[J]. Immunity, 2010,33(5):657-70.

[13] Hung CH, Huang HR,Huang CJ, et al. Purification and cloning of carp nephrosin, a secreted zincendopeptidase of the astacin family[J]. J Biol Chem, 1997,272(21):13772-8.

[14] Sterchi EE,Stocker W, Bond JS. Meprins, membrane-bound and secreted astacinmetalloproteinases[J]. Mol Aspects Med, 2008,29(5):309-28.

[15] Song HD, Sun XJ,Deng M, et al. Hematopoietic gene expression profile in zebrafish kidneymarrow[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004,101(46):16240-5.

[16] Tobin DM, May RC,Wheeler RT. Zebrafish: a see-through host and a fluorescent toolbox to probehost-pathogen interaction[J]. PLoS Pathog, 2012,8(1):e1002349.